隨著越來越多的重組抗體應用于傳染性疾病中，人們對于此類抗體藥物越來越關注，尤其是針對目前尚無疫苗的高危人群和病原體的重組抗體。然而，表現為機會性或潛伏性感染的病原體表達復雜的毒力相關蛋白陣列，并擅長躲避免疫應答。一些病原體已經發(fā)展出有選擇性地破壞抗體的策略，而另一些則制造誘餌表位，欺騙宿主免疫系統(tǒng)產生抗體，這些抗體輕則沒有保護作用，重則推進了發(fā)病機制。以重組抗體為代表的抗體工程策略可以通過訪問保守的中和表位、生成Fc結構域來阻止捕獲或降解，甚至訪問隱藏在細胞內的病原體，從而阻礙這些努力。病原體耐藥抗體的設計可以增強對這些復雜病原體的保護并指導疫苗免疫原的開發(fā)。設計針對特定病原體防御機制的重組抗體可以從三個方面著手：靶向屏蔽脆弱表位的病原體、靶向破壞抗體 FC 功能的病原體、靶向破壞宿主免疫力的病原體，今天我們主要介紹如何針對病原體保護脆弱的抗原表面進行抗體的設計和重組。

針對病原體保護脆弱的抗原表位

抗體靶向的一個關鍵要求是易于識別病原體相關分子。最佳靶點由不同組織和感染的多個階段由大多數菌株表達表達，易于獲得，這些靶點要么在疾病進展中發(fā)揮關鍵功能，要么募集調理素介導病原體破壞。這為病原體隱藏這些脆弱的表位提供了選擇壓力。對中和抗體和非中和抗體復合物中病毒糖蛋白的結構-功能研究揭示了抗體逃逸的共同機制，包括抗原漂移、表位屏蔽和免疫向優(yōu)勢但非保護性表位的定向。這些見解結合新的表位特異性和靶點未知的抗體發(fā)現工具，支持設計更有彈性的藥物性抗體。

結合抵抗抗原漂移的保守表位的抗體

人們在確定靶向包膜病毒(包括RSV、流感病毒、HIV和冠狀病毒)保守表位的抗體方面已經投入了大量工作，從而開發(fā)出可預防多種毒株的廣譜反應性抗體和疫苗。這些病毒利用融合糖蛋白入侵宿主細胞，首先附著在宿主細胞受體上，然后經歷巨大的構象變化將病毒和宿主的膜結合在一起并介導膜融合。確定中和抗體的努力集中在受體結合域，以阻斷這種初始相互作用。

事實上，這些區(qū)域具有高度的免疫原性，結合關鍵表位的抗體可有效中和。對RSV F融合蛋白進行的重要研究表明，融合前構象比融合后構象包含更多的中和表位，并且這些表位可能在構象變化過程中丟失。抗體D25與融合前位點Ø結合，從而阻斷受體結合，中和RSV的效力比目前臨床使用的識別融合后表位的抗體(帕利珠單抗)高50倍。D25作為Nirsevimab正在通過臨床試驗取得進展，其半衰期Fc延長，可以單次給藥。

鑒定這種強效抗體對于其他病毒來說一直具有挑戰(zhàn)性，部分原因是受體結合域的高度序列變異，這通常會限制抗體的中和作用僅局限于少數毒株。

在SARS-CoV-2中，多種抗體阻斷梭原刺突蛋白與ACE2受體獲得了緊急使用授權，但由于新變異株的突變而迅速失效。因此需要鑒定參與保守殘基的中和抗體，通常在隱秘的表位中，不易受到抗原漂移的影響。納米抗體在這種情況下特別有用，因為它們的小尺寸和長CDR3環(huán)可以進入IgG抗體無法獲得的表位，因此不太容易受到人體免疫系統(tǒng)壓力引起的抗原漂移的影響。一項針對免疫駱駝的努力確定了數百個CDR3納米抗體家族，靶向穗峰。其中包括具有皮摩爾親和力的強效納米抗體，可在動物模型中中和多種SARS-CoV-1和2毒株，而其高穩(wěn)定性支持經鼻給藥，從而在感染部位達到治療濃度。為了誘導抗體與保守的中和第4類和1/4類表位結合，用含有來自8株菌株的受體結合域嵌合體的納米顆粒進行免疫似乎有希望。這一領域的巨大努力凸顯了找到中和可變受體結合域的交叉反應性抗體的挑戰(zhàn)和前景。

Figure 1  Key domains and antibody-targeted vulnerable sites in viral fusogen proteins from SARS-CoV-2, HIV-1, and influenza. For each virus, the overall interactions with the respective cellular receptor are shown along with the structure of each corresponding fusogen, indicating key domains and epitopes. Structures for influenza hemagglutinin H3 are from PDB 4FNK, for the HIV-1 envelope from PDB 5CJX, and for the SARS-CoV-2 spike from PDB 7SXT. Abbreviation: MPER, membrane-proximal external region. Adapted from images created with BioRender.

鑒定與罕見的、保守的中和表位結合的抗體的另一種方法是鑒定那些與功能受限的表位結合的抗體。在融合糖蛋白中，這包括發(fā)生構象變化的高度保守區(qū)域，或稱為莖、柄或S2域。在一項感染研究中，在流感中，結合該區(qū)域的血清抗體與保護作用相關，而且這些抗體似乎不太容易被病毒逃逸大多數中和抗體結合的是血凝素受體結合頭結構域內的毒株特異性表位，而與融合柄結合的抗體可通過抑制低ph核內體中膜融合所需的構象重排和招募Fc效應蛋白功能來中和多個病毒群(Figure 1)。Guthmiller等發(fā)現了一個高度保守的血凝素錨定表位，該表位在人類B記憶庫中常見。結合這一表位的抗體可穩(wěn)定病毒膜附近的血凝素，從而中和廣泛的H1毒株、潛在的大流行H2和H5毒株以及常見的A388V柄逃逸變異株。同樣，3A3抗體和7A3納米抗體均靶向高度保守的β冠狀病毒鉸鏈，從而結合廣泛的毒株，而且7A3已被證明保護表達ACE2的人小鼠免受Delta SARS-CoV-2感染。結合保守干性表位的抗體可以識別廣泛的毒株，但它們對保護作用的貢獻尚未完全清楚。

這些成功激發(fā)了人們對識別其他靶蛋白(包括復雜細菌病原體表達的蛋白)上高度保守的表位的興趣。結合細菌表面的保護性抗體可通過Fc受體直接介導吞噬作用或激活補體，導致C3b調理作用，繼而吞噬作用或直接溶解細菌。一個關鍵限制是抗原表面密度必須足夠高，以支持觸發(fā)這些事件所需的抗體和受體聚集。就腦膜炎奈瑟菌而言，每個細胞似乎都需要>757因子H蛋白。目標蛋白也應該是必需的，因為殺菌抗體可導致抗原丟失，正如觀察到的蛋白百日咳黏著素(pertactin)一樣，許多百日咳鮑特菌疫苗中含有百日咳黏著素。為此，通過篩選人類供體細胞，發(fā)現了與保守和保護性肺炎鏈球菌抗原肺炎鏈球菌組氨酸三聯(lián)體蛋白PhtD結合的抗體。這些蛋白與來自幾種血清型莢膜細菌的抗原結合，保護小鼠免受原發(fā)性和繼發(fā)性攻擊，為單獨靶向>100不同莢膜血清型提供了一種潛在的替代方案。同樣，萊姆病病原體伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)外表面蛋白VlsE(表達的可變主要蛋白樣序列)的保守區(qū)域已被確定，但它們的治療潛力仍有待確定。這些報告令人興奮，因為它們提示結合細菌表面蛋白的抗體可用于補充結合細菌碳水化合物的抗體。

進入隱藏表位的抗體

抗體可以接觸到溶劑暴露的表位，這對抗原漂移產生壓力，從而逃避抗體結合。因此，病原體可以遮蔽保守的和功能重要的表位。一種策略是提出高免疫原性但無保護性的誘騙表位，以限制抗體對鄰近易損表位的識別。

與這一高度保守的表位結合的抗體很罕見，因為它毗鄰一個免疫顯性和高可變的環(huán)。從免疫原中刪除該環(huán)可誘導產生高水平IgG22樣抗體，從而保護小鼠免受不同β-人冠狀病毒的感染。類似地，人巨細胞病毒gB融合原在抗原結構域2中包含一個高度保守的位點1(跨越第69 ~ 78位殘基)，該位點可誘導產生有效的保護性抗體。該位點被與相鄰位點2(跨越殘基50 ~ 54)和免疫顯性抗原域1結合的抗體有效掩蓋，這兩個位點都主要引起非中和抗體。根據IgG22報告推斷，未來的免疫原設計工作可能能夠將免疫應答集中在gB位點1和其他抗原中的次優(yōu)勢但具有保護作用的表位。

第二種策略是使用糖基化位點來屏蔽脆弱的表位。HIV-1包膜被>25 n連接的糖基化位點修飾，這些糖基化位點保護了廣泛中和表位，包括V1V2位點，即gp120上的第一個和第二個可變區(qū)(圖1)。在RV144疫苗的Ⅲ期試驗中，V1V2結合抗體介導Fc效應功能(抗體依賴性細胞吞噬和補體激活)，而不是廣泛中和作用，從而與保護作用相關。該區(qū)域在許多供體中引起交叉反應性抗體，但需要廣泛的體細胞超突變和長CDRH3環(huán)才能訪問表位。與先前的結合V1V2的抗體PG9不同，CAP256-VR26抗體系結合V1V2區(qū)域，并在耐受刺突聚糖N160和N156丟失的情況下產生了有效的fc介導的保護作用。其他廣泛的HIV中和抗體需要多年的成熟和廣泛的體細胞超突變，與之不同，CAP256-VRC26.08包含的突變要少得多，這可以簡化通過接種疫苗產生類似抗體的策略。

第三種策略是結構阻斷易損表位。例如，受體結合表位可僅在需要與受體結合時短暫暴露。SARS-CoV-1/-2 交叉反應抗體CR3022已報告了這一點，該抗體與一個隱表位結合，當受體結合結構域處于下降狀態(tài)時隱藏，但當該域轉變?yōu)樯蠣顟B(tài)并與ACE2受體結合時隱表位被暴露。同樣，廣中和抗HIV抗體3BNC117和10-1074僅在CD4與HIV-1包膜接合以暫時暴露脆弱的CD4結合位點。因此，只有在存在小分子CD4模擬物的情況下，接種HIV-1 gp120變異株的非人靈長類動物對HIV-1感染T細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)改善。gp41包膜蛋白的膜近端外部區(qū)域引發(fā)最廣泛的中和單克隆抗體（例如4E10、LN01、VRC42），但這些很少見，因為該表位僅在融合前至融合后的轉化過程中短暫暴露。可能需要同時給藥兩種抗體才能接近某些表位:一種抗體可使靶蛋白穩(wěn)定在開放狀態(tài)(例如受體模擬物)，另一種抗體可與敏感表位結合。

靶向可變抗原的抗體

上述例子突顯了靶向僅需要少數蛋白質就可感染細胞的病毒的易損表位所面臨的挑戰(zhàn)。將這些策略應用于表達更多表面抗原的細菌病原體會帶來額外的挑戰(zhàn)，因為在許多情況下，靶點的關鍵分子并不明顯。

鑒于細菌碳水化合物(脂多糖和莢膜多糖)的豐度、可及性和免疫原性，它們一直是主要靶點。事實上，使用腦膜炎奈瑟氏菌血清群A膠囊的糖綴合物接種疫苗幾乎消除了該血清群的臨床病例。遺憾的是，這些分子也具有高度的變異型:雖然銅綠假單胞菌脂多糖疫苗在動物模型中可誘導保護性免疫，但存在20種以上 o抗原血清型，許多有多個亞型，因此有必要開發(fā)血清型特異性治療方法。

鑒于細菌碳水化合物的多樣性和產生針對這些柔性分子的抗體的挑戰(zhàn)，保守表面蛋白可能更適合作為抗體靶點。鑒定出一種與大腸桿菌必需外膜輸出蛋白BamA結合的抗體，該抗體與一個細胞外環(huán)結合，從而破壞BamA功能。抗體結合誘導細菌應激反應，破壞外膜完整性，并在亞納摩爾濃度(49)下殺死細菌。然而，由于外膜蛋白隱藏在表面碳水化合物之下，因此該抗體僅對具有最小脂多糖結構的菌株有效。

盡管已經鑒定出成功的抗原，如腦膜炎奈瑟氏菌H因子(22)和肺炎鏈球菌PhtD蛋白，但這些報告凸顯了預先選擇合適的細菌靶點的挑戰(zhàn)。為了替代使用靶向未知方法分離抗體，DiGiandomenico等從感染患者和健康人中鑒定出與完整銅綠假單胞菌細胞結合的抗體，并對其進行調理吞噬細胞殺傷篩選。一組單基因敲除的銅綠假單胞菌分離株表明，所有選擇的抗體均結合了表面暴露的多糖Psl，該多糖在多個菌株中保守，并在多種疾病狀態(tài)下表達。抗ps1鉛抗體Cam-003結合了173株銅綠假單胞菌臨床分離株中的85%，盡管親和力僅為144 nM，但在小鼠急性致死性肺炎模型中提供了強大的保護作用。

病原體的適應性需要抗體靶向方法的創(chuàng)新。這可以包括使用來自多個毒株的抗原誘餌來識別針對已知靶點的交叉反應性抗體的抗體發(fā)現策略，這種方法已經識別了結合不同病毒表位的一系列抗體。為了將這些方法擴展到更復雜的細菌病原體，靶向未知方法以及隨后對所需功能的廣泛篩查顯示出了希望。

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